如何高效率實現(xiàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染：陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑，以其適用宿主范圍廣，操作簡便，對細(xì)胞毒性小，轉(zhuǎn)染效率高受到研究者們的青睞。脂質(zhì)體（liposome）是一種人工膜，在水相中形成具有雙分子層結(jié)構(gòu)的球形封閉囊泡。脂質(zhì)體可以和帶負(fù)電荷的核酸結(jié)合后重新形成復(fù)合物，當(dāng)復(fù)合物接近細(xì)胞膜時，通過內(nèi)吞作用形成內(nèi)體（endosomes）進(jìn)入細(xì)胞，通過緩沖液的作用以及脂質(zhì)與內(nèi)體膜融合，增大內(nèi)體的內(nèi)部滲透壓，使內(nèi)體結(jié)構(gòu)破壞，釋放出核酸。隨后DNA復(fù)合物被釋放進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。對于普通細(xì)胞系，一般的瞬時轉(zhuǎn)染方法多采用脂質(zhì)體法。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法較重要的就是防止其毒性，因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例，細(xì)胞密度以及轉(zhuǎn)染的時間長短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要因素，通過實驗優(yōu)化合適的轉(zhuǎn)染條件對于轉(zhuǎn)染效率的提高很重要。細(xì)胞轉(zhuǎn)染是完成這一過程的必需步驟。武漢正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑推薦廠家

如何高效率實現(xiàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染：DNA轉(zhuǎn)染導(dǎo)入細(xì)胞胞漿內(nèi)的DNA不能穿過細(xì)胞核的核膜（"核屏障"）。在細(xì)胞有絲分裂過程中核膜溶解，DNA進(jìn)入細(xì)胞核才有可能。為此，細(xì)胞處于分裂期對DNA轉(zhuǎn)染是至關(guān)重要的，并且處于分裂期的細(xì)胞比例必須盡可能大才能實現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染。DNA轉(zhuǎn)染機(jī)制示意圖如下所示：轉(zhuǎn)染RNA(siRNA/miRNA/mRNA)對于RNA轉(zhuǎn)染是沒有"核屏障"的，因為RNA不需要進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，因此細(xì)胞分裂對它沒有影響。轉(zhuǎn)染試劑的選擇理想的轉(zhuǎn)染試劑選擇可以使您的實驗如虎添翼！真核細(xì)胞的先天免疫系統(tǒng)，使它們能夠檢測外來物質(zhì)如脂多糖、細(xì)菌或細(xì)菌核酸和蛋白質(zhì)，并克制潛在病原體的入侵。此外，細(xì)胞通過信使分子向臨近細(xì)胞傳遞發(fā)現(xiàn)有害物質(zhì)的信號。因此，這些臨近細(xì)胞甚至無需接觸病原體即可采取防御方式。這種細(xì)胞先天免疫系統(tǒng)也是轉(zhuǎn)染成功的一個障礙。貴陽細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑單價轉(zhuǎn)染試劑與細(xì)胞不匹配細(xì)胞轉(zhuǎn)染較適合的不是原代細(xì)胞。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗簡介：實驗原理外源基因進(jìn)入細(xì)胞主要有四種方法：電擊法、磷酸鈣法和脂質(zhì)體介導(dǎo)法和細(xì)菌介導(dǎo)法。電擊法是在細(xì)胞上短時間暫時性的穿孔讓外源質(zhì)粒進(jìn)入;磷酸鈣法和脂質(zhì)體法是利用不同的載體物質(zhì)攜帶質(zhì)粒通過直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進(jìn)入細(xì)胞;細(xì)菌法是利用包裝了外源基因的細(xì)菌傳染細(xì)胞的方法使得其進(jìn)入細(xì)胞。但是由于電擊法和磷酸鈣法的實驗條件控制較嚴(yán)、難度較大;細(xì)菌法的前期準(zhǔn)備較復(fù)雜、而且可能對于細(xì)胞有較大影響;所以現(xiàn)在對于很多普通細(xì)胞系，一般的瞬時轉(zhuǎn)染方法多采用脂質(zhì)體法

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的注意事項：物品(PS)物品，比如青霉素和鏈霉素，是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些物品一般對于真核細(xì)胞無毒，但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性，使物品可以進(jìn)入細(xì)胞。這降低了細(xì)胞的活性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。所以，在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用物品，甚至在準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染前進(jìn)行細(xì)胞鋪板時也要避免使用物品。這樣，在轉(zhuǎn)染前也不必潤洗細(xì)胞。對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素，ICIN選擇性物品的競爭性克制劑。另外，為了保證無血清培養(yǎng)基中細(xì)胞的健康生長，使用比含血清培養(yǎng)基更少的物品量~在轉(zhuǎn)染過程中是可以使用血清的。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的常用方法：細(xì)菌轉(zhuǎn)染：原理：對于用脂質(zhì)體不能實現(xiàn)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，可以采用細(xì)菌轉(zhuǎn)染。可用于蛋白質(zhì)過表達(dá)或克制，是臨床研究中較常用的方法。它通過侵染宿主細(xì)胞將外源基因整合到染色體中，可用于難轉(zhuǎn)染細(xì)胞、原代細(xì)胞的穩(wěn)定性轉(zhuǎn)染。實驗步驟：通過基因克隆生成重組細(xì)菌→采用非細(xì)菌法轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系，擴(kuò)增并分離得到重組細(xì)菌顆粒→純化并滴定細(xì)菌液→轉(zhuǎn)導(dǎo)目的細(xì)胞（含有細(xì)菌特異性的受體）→去除培養(yǎng)物中的細(xì)菌，并加入新鮮培養(yǎng)基→分析細(xì)胞瞬時基因表達(dá)或沉默情況。是目前實驗室較方便的轉(zhuǎn)染方法之一，其轉(zhuǎn)染率較高，優(yōu)于磷酸鈣法。珠海細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑

瞬時轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，外源基因得以表達(dá)但它們并不會整合到細(xì)胞的基因組中。武漢正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑推薦廠家

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的常用方法：人工脂質(zhì)體法原理：帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物，進(jìn)而可被細(xì)胞內(nèi)吞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染/瞬時性轉(zhuǎn)染。這種方法幾乎適用于所有細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率高、重復(fù)型好，但轉(zhuǎn)染時需要去除血清，轉(zhuǎn)染效果隨細(xì)胞類型變化大。實驗步驟：在單獨(dú)試管中分別稀釋核酸及轉(zhuǎn)染試劑→脂質(zhì)體與核酸的磷酸骨架結(jié)合，形成復(fù)合物→脂質(zhì)體上的正電荷有助于復(fù)合物與細(xì)胞膜結(jié)合→復(fù)合物通過內(nèi)吞作用進(jìn)入胞漿→分析細(xì)胞瞬時基因表達(dá)或沉默情況。武漢正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑推薦廠家