鼠尾膠原醋酸溶解：1．將鼠尾膠原加入到0.1M的醋酸中，制備成濃度為0.1%的溶液。在室溫中攪拌1-3小時直到完全溶解。2．建議將溶液轉(zhuǎn)移到擰口的玻璃瓶中，并小心的在瓶底鋪上一層氯仿。氯仿的量約為膠原溶液的10%。不要晃動或攪拌。在2-8度中放置過夜。在無菌條件下轉(zhuǎn)移上層的膠原溶液。我們不建議用過濾的方法無菌化。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該方法會導致丟失蛋白。3．稀釋一定數(shù)量的膠原溶液。4．按照6-10ug/cm2的濃度包被培養(yǎng)瓶。在室溫或37度結(jié)合數(shù)小時或者2-8度過夜。5．從包被表面除去多余的液體。過夜干燥。如果膠原溶液不是無菌的，這時候可以在無菌細胞操作室中暴光在紫外線下過夜消毒。在接種細胞前用無菌的水漂洗。免疫組織化學結(jié)果和掃描電鏡證實所培養(yǎng)的細胞具有典型的分泌上皮細胞特征。貴陽鼠尾膠原生產(chǎn)廠家

鼠尾膠原蛋白I型在濃度1mg/ml以上，pH7左右時可形成具有一定強度三維膠,建議成膠濃度1-2mg/ml。膠原蛋白溶解于0.006mol/L乙酸中，在成膠過程中需要加入0.06X體積的0.1mol/LNaOH來中和。需要的溶液(均需要無菌、預冷):10xPBS(可含10mg/L的酚紅用于pH指示)或10x培養(yǎng)液,0.1mol/LNaOH,0.1mol/L乙酸(一般不用),雙蒸水不含細胞的三維膠原的制備（以配制1毫升，1mg/ml三維膠為例）：將200ul生友鼠尾膠原蛋白I型(5mg/ml)加到置于冰浴的離心管中，加入690ulH2O。然后加到12ul0.1mol/LNaOH中（如果反過來把12ul0.1mol/LNaOH加到膠原溶液中，會由于NaOH不能迅速混勻而產(chǎn)生局部的膠原凝結(jié)），立即混勻。再加入100ul10xPBS或10x培養(yǎng)液，混勻后立即加到培養(yǎng)器皿中(混勻后pH為7左右，如果PBS或培養(yǎng)液中沒有加酚紅，初次使用時需要用pH試紙測試)。上海北京鼠尾膠原制備鼠尾膠原：離心，4000轉(zhuǎn)/分，10-15分鐘。

鼠尾膠原備用膠凝程序：1）在冰上放置以下物品：膠原蛋白I、無菌10×PBS、無菌蒸餾水、無菌1MNaOH。2）確定膠原蛋白I待使用溶液所需的較終濃度的體積。3）在冰上放置無菌管以收存膠原蛋白I。4）在無菌條件下執(zhí)行以下步驟。4.1加入10×PBS（終體積/10）mL4.2計算要使用的膠原蛋白I的體積（不要添加到管中直到步驟4.6為止）終體積x終膠原蛋白I濃度（mg/mL）。4.3向10×PBS溶液中加入（要加入的膠原體積×0.023）mL的無菌冰冷1MNaOH。4.4向4.3溶液中加入下述體積的無菌冰冷蒸餾水：添加蒸餾水體積=V（終）—V（膠原蛋白）—V(10×PBS）—V（1MNaOH）4.5混合管中的物質(zhì)并放入冰中。4.6加入膠原蛋白I并計算體積，混勻，冰上備用。5）膠原蛋白I溶液可立即使用或在冰上放置2-3小時。6）使用時，無菌條件下將溶液加入到細胞培養(yǎng)裝置中37°C凝膠30min。論鼠尾膠原能促進毛細胞貼壁，涂布鼠尾膠原有利于膜片鉗實驗的長時程記錄，并且制作簡便，成本低廉。

鼠尾膠原實驗應(yīng)用：鼠尾膠原在原代培養(yǎng)耳蝸血管紋邊緣細胞中的應(yīng)用。目的：建立利用自制的鼠尾膠原培養(yǎng)大鼠耳蝸邊緣細胞的方法。方法:制作鼠尾膠原,并觀察利用自制的鼠尾膠原所培養(yǎng)出大鼠耳蝸邊緣細胞的效果。結(jié)果：自制的鼠尾膠原能正常地培養(yǎng)出大鼠耳蝸邊緣細胞，細胞角蛋白18表達陽性，免疫組織化學結(jié)果和掃描電鏡證實所培養(yǎng)的細胞具有典型的分泌上皮細胞特征。結(jié)論：成功建立了利用自制鼠尾膠原培養(yǎng)大鼠耳蝸邊緣細胞的方法，并且制作簡便,成本低廉。吸去生理鹽水，將尾腱稱重（0.5-1克）。

使用方法：1、細胞培養(yǎng)器皿的表面包被：以包被濃度為2μg/cm2為例，用無菌0.006mol/L乙酸將膠原蛋白稀釋到0.012mg/mL。加到相應(yīng)的培養(yǎng)器皿中，確保膠原蛋白溶液鋪滿器皿的表面。開蓋在超凈臺上過夜晾干，也可以在室溫放置1小時后，用PBS洗3~4次后直接使用。包被好的器皿在4~25℃至少可保存三個月以上的時間。2、三維膠原凝膠的制備：A、無細胞三維膠原凝膠的制備（以配制1mg/mL三維膠1mL為例）將200μL本品加到置于冰浴的離心管中，加入690μL雙蒸水，然后加到12μL0.1mol/LNaOH中（如果反過來把12μL0.1mol/LNaOH加到膠原溶液中，會由于NaOH不能迅速混勻而產(chǎn)生局部的膠原凝結(jié)），立即混勻。再加入100μL10×PBS或10×培養(yǎng)液，混勻后立即加到培養(yǎng)器皿中（混勻后pH為7左右，如果PBS或培養(yǎng)液中沒有加酚紅，初次使用時需要測定pH值）。將培養(yǎng)器皿在室溫放置20min待膠凝固后，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱內(nèi)。如果配制中使用的是10×PBS，使用前需要加入適當體積的細胞培養(yǎng)液預平衡。將培養(yǎng)器皿在室溫放置20min待膠凝固后，加入適當體積的細胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。深圳鼠尾膠原廠家

手持尾巴，用止血鉗夾住鼠尾的較高，折斷尾骨后拉出尾腱。貴陽鼠尾膠原生產(chǎn)廠家

鼠尾Ⅰ型膠原：選擇適當?shù)墓切迯筒牧鲜侵魏霉侨睋p的中心環(huán)節(jié)。目前，臨床上常用的有人工骨移植、自體骨移植和同種異體骨移植。其中，人工骨材料多為磷酸三鈣、半水硫酸鈣等含有鈣和磷的無機礦物材料[1-2]，由于不含自體骨組織中的有機大分子Ⅰ型膠原蛋白，其臨床療效遠遠低于自體骨組織。但是，自體骨移植和同種異體骨移植均來源于人類自身骨組織，數(shù)量有限，難以滿足臨床需要。因此，研發(fā)與人類自體骨組織化學成分和分子結(jié)構(gòu)相近的仿生骨材料，成為全世界骨組織工程學者孜孜以求的目標。由于天然骨組織是Ⅰ型膠原蛋白和羥基磷灰石鈣生物礦化的產(chǎn)物，在分子結(jié)構(gòu)上，羥基磷灰石鈣晶體是以Ⅰ型膠原纖維為模板，呈片狀鑲嵌在膠原纖維分子間隙，沿著膠原纖維的長軸縱向礦化生長[3]。本研究仿生天然骨組織的分子結(jié)構(gòu)，酸解提取鼠尾肌腱的Ⅰ型膠原蛋白，重構(gòu)形成Ⅰ型膠原纖維，然后將Ⅰ型膠原纖維放置在礦化液中模擬人體內(nèi)骨生物礦化，通過透射電子顯微鏡(TEM)和電子衍射觀察羥基磷灰石鈣晶體在膠原纖維內(nèi)部的骨生物礦化。貴陽鼠尾膠原生產(chǎn)廠家