DNA合成儀在基因編輯中的適用性研究

來源：發(fā)布時間：2025-10-27

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本文展示了如何使用Kilobaser one-XT DNA/RNA合成儀制備 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)所需的 DNA 模板，進而轉(zhuǎn)錄生成sgRNA；實驗發(fā)現(xiàn)，合成過程中殘留的保護基團、鹽等會抑制轉(zhuǎn)錄酶和脫氧核糖核酸酶活性，而通過OliPure HIC 純化試劑盒去除殘留物后，該 DNA 模板轉(zhuǎn)錄的 sgRNA 產(chǎn)量與功能，與寡核苷酸供應商提供的 DNA 模板完全一致；**終證明，將 Kilobaser 合成儀、標準試劑與純化試劑盒結(jié)合，可讓任何實驗室自主實現(xiàn) CRISPR/Cas9 介導的基因編輯。

思維導圖

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一、**背景與結(jié)論·

技術(shù)基礎(chǔ)：CRISPR/Cas9是 RNA 引導的基因編輯工具，體外應用需通過轉(zhuǎn)錄 DNA 模板制備sgRNA，市售體外轉(zhuǎn)錄試劑盒可在30 分鐘內(nèi)完成 sgRNA 制備。

· **問題：轉(zhuǎn)錄試劑盒中的轉(zhuǎn)錄酶和脫氧核糖核酸酶會被 DNA 合成殘留物（鹽、保護基團、截短寡核苷酸等）抑制。

· 解決方案：使用Kilobaser one-XT 合成儀合成 DNA 模板，搭配OliPure HIC 純化試劑盒去除殘留物。

· 實驗結(jié)論：純化后的 Kilobaser DNA 模板，與寡核苷酸供應商提供的模板相比，轉(zhuǎn)錄的 sgRNA產(chǎn)量和功能完全一致，證明該組合可支持實驗室自主 CRISPR/Cas9 基因編輯。

· 二、CRISPR/Cas9 系統(tǒng)**原理

（一）系統(tǒng)組成CRISPR/Cas9 切割系統(tǒng)主要由單導向 RNA（sgRNA）和 Cas9 核酸酶構(gòu)成。其中，sgRNA 是經(jīng)工程改造的單一序列，由天然的 crRNA（負責引導 Cas9 定位至目標 DNA 位點，含與 DNA 靶序列互補的 20nt 靶向區(qū)域）和 tracrRNA（為 Cas9 結(jié)合提供支架，由三個莖環(huán)組成）組成。

（二）切割機制

1. sgRNA 先與 Cas9 核酸酶結(jié)合，形成 Cas9-sgRNA 復合物，此復合物會使 Cas9 進入活性構(gòu)象，隨后掃描相鄰雙鏈 DNA 以尋找 3 個堿基對的 NGG 原間隔區(qū)相鄰序列（PAM）。

2. 結(jié)合 PAM 序列后，雙鏈 DNA 解旋，sgRNA 可與其中一條 DNA 鏈退火；若 PAM 附近 DNA 序列與 sgRNA 的 crRNA 序列充分互補，Cas9 會切割 DNA 靶標，產(chǎn)生平端雙鏈斷裂。

3.實際負責切割的是 Cas9 的兩個**結(jié)構(gòu)域：RuvC 結(jié)構(gòu)域負責切割非互補 DNA 鏈，HNH 結(jié)構(gòu)域負責切割互補 DNA 鏈。

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圖1、CRISPRICas9系統(tǒng)對DNA的切割作用。SgRNA(由crRNA和tracrRNA組成)在基因組DNA上定位并***Cas9核酸酶。Cas9的精確定位取決于cIRNA與靶DNA及PAM序列互補的DNA鏈結(jié)合。在PAM序列附近，兩種核酸酶結(jié)構(gòu)域-RuvC和HNH--分別切割兩條DNA鏈，形成雙鏈斷裂。

三、sgRNA 體外制備關(guān)鍵環(huán)節(jié)

1. 常規(guī)方案：用 NEB 的 EnGen® sgRNA 合成試劑盒，經(jīng) “寡核苷酸雜交→雙鏈 DNA 延伸→DNA 轉(zhuǎn)錄” 三步，1 小時內(nèi)合成 sgRNA，但需高質(zhì)量 DNA 模板。

2. **問題：Kilobaser 合成儀制備 DNA 模板時，會產(chǎn)生抑制轉(zhuǎn)錄酶、DNase 的殘留物（鹽、保護基團等），影響 sgRNA 合成與功能。

3. 解決方案：用 OliPure HIC 純化試劑盒去除殘留物，可消除抑制作用。

四、實驗設(shè)計與結(jié)果

1. DNA 模板：設(shè)計 55nt 序列（T7 啟動子 + 5'-dG+crRNA+SpCas9 支架），用 Kilobaser 合成后分 “純化 / 未純化” 組，以供應商模板為對照。

2. sgRNA 合成：純化組 sgRNA 產(chǎn)率（4~25μg）與供應商模板一致，未純化組產(chǎn)率比較低。

3. Cas9 活性檢測：純化組制備的 sgRNA 切割質(zhì)粒效率高（2.5kb 線性條帶明顯，未裂解質(zhì)粒少）；未純化組切割效率低；對照（* sgRNA / * Cas9）無切割，證明 sgRNA 靶向有效。

五、結(jié)論

CRISPR/Cas9 的適用性依賴 sgRNA 的質(zhì)量與可獲得性，對于頻繁使用該技術(shù)的研究實驗室，內(nèi)部合成是質(zhì)量解決方案。Kilobaser one 合成器可快速、簡便制備靶標特異性 DNA 寡核苷酸，作為體外轉(zhuǎn)錄試劑盒的 DNA 模板；但需通過 OliPure HIC 試劑盒去除合成殘留物（避免干擾酶活性），純化后的 Kilobaser DNA 寡核苷酸能為 CRISPR/Cas9 切割系統(tǒng)提供功能性 sgRNA，因此 Kilobaser one-XT DNA 合成儀實驗室自主開展 CRISPR/Cas9 相關(guān)研究的可靠工具。

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