轉染方式:細胞由帶負電荷的磷脂雙分子層構成,這對大分子物質來說是個不可透過的屏障,比如DNA和RNA的磷酸骨架,其也帶負電荷。為了使核酸穿過細胞膜,研究人員開發了多種技術,大致分為三類:化學方法---利用載體分子包被核酸使其呈現中性電荷或正電荷。生物方法---利用基因工程細菌轉染非細菌基因到細胞中。物理方法---在細胞膜表面產生一個瞬時的孔從而導入DNA。然而,沒有一種方法適用于所有的細胞和實驗,理想的方法應根據您的細胞類型和實驗需要進行選擇,理想的方法應具有高轉染效率,低細胞毒性和對正常生理學的影響較小,并且易于使用和可重復性等特點。陽離子脂質體轉染試劑脂質轉染試劑,以其適用宿主范圍廣。濟南...
大多數已建立的細胞系都是非整倍體,原代培養包括了表達不同基因組合的細胞的混合物。細胞培養在實驗室中保存數月和數年后會經歷突變,總染色體重組或基因調控變化等而演化,這會導致和轉染相關的細胞行為的變化。如果隨時間發現這種變化,融化一管新鮮的細胞可能會恢復原先的轉染活性。比如,新鮮融化的NIH3T3細胞比傳代8次的細胞表現出更高的轉染效率,融化細胞的進一步傳代并沒有降低轉染效率。因此,如果觀察到轉染效率降低,可以試著轉染新鮮培養的細胞以恢復較佳結果。較適合轉染的細胞是經過幾次傳代后達到對數生長期的細胞。廈門細胞高效轉染試劑哪里買如何提高細胞轉染實驗效率:優化細胞生長狀態密切觀察您的細胞;確保它們狀態...
細胞轉染的原理、操作步驟以及小技巧:脂質體轉染操作步驟:(1)細胞培養:取6cm細胞皿,向每孔中加入2mL含1~2×105個細胞培養液,37℃CO2培養密度至40%~60%,密度過大,轉染后不利篩選細胞。(2)轉染液制備:在EP管中制備以下兩液(為轉染每一個孔細胞所用的量)A液:用不含血清培養基稀釋1ug質粒DNA。B液:用不含血清培養基稀釋2ul脂質體。分別將A液與B液輕彈混勻,靜置5分鐘。(3)吸取B液加入至A液中,輕彈混勻。室溫中置10-15分鐘。(4)轉染準備:用1mL不含血清培養液漂洗兩次,再加入4mL不含血清培養液。(5)轉染:把A/B復合物緩緩加入培養液中,搖勻,37℃溫箱置6~...
細胞轉染的注意事項:1.細胞鋪板密度用于轉染的較佳細胞密度根據不同的細胞類型或應用而異。因轉染試劑對細胞有毒害作用,細胞太少,容易死。一般轉染時,貼壁細胞密度為70%-90%,懸浮細胞密度為2-4×106細胞/ml,確保轉染時細胞沒有長滿或處于靜止期。因為轉染效率對細胞密度很敏感,所以在不同實驗間保持一個基本的傳代步驟很重要。鋪板細胞數目的增加可以增加轉染活性和細胞產量。細胞的融合度必須要達到90%才能做啟動子的選擇獲得高轉染活性所需選擇的啟動子依賴于選用的細胞系和要表達的蛋白。CMV啟動子在大多數細胞類型中可以獲得高表達活性。同其他啟動子,如SV40和RSV(勞斯肉瘤細菌)相比,在BHK-2...
細胞轉染為什么不能加血清:傳統的轉染試劑一般會增加細胞的通透性,這樣會把血清中的成分帶入細胞,造成細胞毒性。陽離子脂質體,轉染的過程是帶正電的脂質體與核酸帶負電的磷酸基團形成復合物被細胞內吞。血清中含有大量的蛋白質,在轉染過程中,帶負電的蛋白質可能干擾陽離子脂質體對核酸的吸附,影響轉染效率。同時,也會將血清中的蛋白帶入細胞,引發細胞毒性,故不能有血清轉染。這些轉染試劑要求在轉染前換無血清培養基,轉染后4-6h在更換成有血清培養基,這其實是為了減輕轉染造成的細胞毒性和轉染效率的降低。轉染試劑與細胞不匹配細胞轉染較適合的不是原代細胞。青島正規細胞高效轉染試劑供應商細胞電轉染實驗的幾點建議:1.電場...
細胞轉染為什么不能加血清:傳統的轉染試劑一般會增加細胞的通透性,這樣會把血清中的成分帶入細胞,造成細胞毒性。陽離子脂質體,轉染的過程是帶正電的脂質體與核酸帶負電的磷酸基團形成復合物被細胞內吞。血清中含有大量的蛋白質,在轉染過程中,帶負電的蛋白質可能干擾陽離子脂質體對核酸的吸附,影響轉染效率。同時,也會將血清中的蛋白帶入細胞,引發細胞毒性,故不能有血清轉染。這些轉染試劑要求在轉染前換無血清培養基,轉染后4-6h在更換成有血清培養基,這其實是為了減輕轉染造成的細胞毒性和轉染效率的降低。大部分外源DNA會被核酸酶降解或隨細胞分裂而稀釋。成都細胞高效轉染試劑生產廠家細胞轉染效率影響因素:1.細胞密度一...
細胞轉染效率低下的幾個大坑:1.準備不足做脂質體轉染的時候,在開展正式實驗前要多做預試驗,優化轉染條件。優化轉染條件包括:脂質體的用量、DNA密度、細胞密度、脂質體和DNA混合孵育時間等等。2.電壓過大做電轉的時候,如果電壓太大,往往會發生細胞大量死亡的情況。不同的細胞,需要的電壓是不一樣的。這就要求我們多做預實驗,多摸索條件。對于大多數細胞來說,其較佳電壓位于250-1250v/cm。另外,就是進行轉染的細胞應該處于對數生長期。處于對數生長期的細胞的抗損傷能力是較強的。細胞濃度應該處于5x106到1x107/mL之間。每次轉染的質粒應該控制在4-6μg,如果﹥10μg,轉染效率也較大降低。電...
細胞轉染操作方法:轉染,是將外源性基因導入細胞內的一種專門技術。隨著基因與蛋白功能研究的深入,轉染目前已成為實驗室工作中經常涉及的基本方法。轉染大致可分為物理介導、化學介導和生物介導三類途徑。電穿孔法、顯微注射和基因屬于通過物理方法將基因導入細胞的范例;化學介導方法很多,如經典的磷酸鈣共沉淀法、脂質體轉染方法、和多種陽離子物質介導的技術;生物介導方法,有較為原始的原生質體轉染,和現在比較多見的各種細菌介導的轉染技術。理想細胞轉染方法,應該具有轉染效率高、細胞毒性小等優點。細菌介導的轉染技術,是目前轉染效率較高的方法,同時具有細胞毒性很低的優勢。但是,細菌轉染方法的準備程序復雜,常常對細胞類型有...
細胞轉染為什么不能加血清:不同的細胞及轉染試劑要求轉染的條件是不同的。較好是在靠前次實驗前做一個預實驗,比如:HeLa,293,CHO,COS7,MCF-7,HepG2等細胞,是否加血清,對不同的細胞是有不同的影響的,有些細胞是可以有血清的,有些加血清就會受影響。轉染后在6小時左右較好換液且換為有血清的培養基,其一因為普通轉染試劑對細胞的毒性作用大,其二可降低因血清的缺乏引起的細胞的死亡。轉染時不加血清是防止血清的干擾作用,轉染后可適時加入。加入過早會引起未轉染細胞的優勢生長,過晚會引起較多細胞死亡。可實時觀察1/5細胞變圓的時候加入血清直到外源基因在細胞分裂過程中因各種因素丟失為止。蘇州正規...
細胞轉染實驗的方法有哪些:1..電穿孔法。通過短暫的高電場電脈沖處理細胞,沿細胞膜的電壓差異會導致細胞膜的暫時穿孔。DNA被認為是穿過孔擴散到細胞內的。電脈沖和場強的優化對于成功的轉染非常重要,因為過高的場強和過長的電脈沖時間會不可逆地傷害細胞膜而裂解細胞。理論上說電穿孔法可用于各種細胞,且不需要另外采購特殊試劑,但需要昂貴的電轉儀。此法每次轉染需要更多的細胞和DNA,因為細胞的死亡率高。每種細胞電轉的條件都需要進行多次優化。2.細菌介導的傳染。傳染需要將目的基因克隆到特定的細菌體系中,經過包裝細胞的包裝得到改造后的細菌,再進行傳染。重新接種于培養皿或瓶,較好在轉染前4小時換一次新鮮培養液。徐...
影響轉染試驗的因素:細胞狀態變化:(1)轉染試劑與細胞不匹配細胞轉染較適合的不是原代細胞,也不是傳代很多次的細胞。這是因為細胞培養在實驗室中保存數月和數年后會經歷突變,總染色體重組或基因調控變化等而演化。這會導致和轉染相關的細胞行為的變化。較適合轉染的細胞是經過幾次傳代后達到對數生長期的細胞,細胞生長旺盛,較容易轉染。(2)把握時機沒錯!轉染也有適當的時機,相比較非分裂細胞——分裂細胞往往要比靜止細胞更易于攝取并表達外源DNA。因此對大多數轉染操作而言,細胞都在轉染當天或前現在種板。同樣重要的是細胞在種板進行轉染時不應處于過度生長的狀態,如細胞數量過多,互相疊加,營養物質耗竭,代謝廢物積聚,轉...
細胞轉染那些事兒:1.選擇傳代次數較低并處于對數生長期的細胞進行轉染。對大多數細胞而言,均需要在轉染當天或前現在鋪板,第二天上午進行轉染,48h后收集細胞進行功能檢測。對于原代細胞,可用促有絲分裂刺激物進行細胞活化。2.對于貼壁細胞,一般要求在轉染前一日,用胰酶處理為單細胞懸液,重新接種于培養皿或瓶,較好在轉染前4小時換一次新鮮培養液。3.支原體污染會嚴重降低細胞轉染的效率,且支原體不會像細菌污染那么明顯,因而轉染前可用環丙沙星處理細胞以除去支原體。加入混合液,將細胞放回培養箱中培養一個小時。南京正規細胞高效轉染試劑服務電話細胞轉染實驗的方法有哪些:1..電穿孔法。通過短暫的高電場電脈沖處理細...
細胞電轉染實驗的幾點建議:1.電場強度要合適合適的電場強度對于電轉染實驗非常重要,電場強度不能過高,過高會增加細胞的死亡率;也不能過低,過低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同細胞系具有不同的較佳場強值,實驗前應測定所轉染細胞系的較佳電場強度。2.細胞狀態要好用于電轉的細胞一般選取處于對數生長期的細胞(15代以內,傳代后2d)。因為處于對數生長期的細胞分裂旺盛,表面結構致密比穩定期的細胞差,電轉后,細胞膜的恢復能力強,而且處于有絲分裂期的細胞更容易接受外源DNA.到時后,根據細胞種類決定是否移除混合液。南昌正規細胞高效轉染試劑銷售廠家細胞轉染效率低下的幾個大坑:1.試劑過期有時候轉染效率低...
細胞轉染實驗的方法有哪些:1..電穿孔法。通過短暫的高電場電脈沖處理細胞,沿細胞膜的電壓差異會導致細胞膜的暫時穿孔。DNA被認為是穿過孔擴散到細胞內的。電脈沖和場強的優化對于成功的轉染非常重要,因為過高的場強和過長的電脈沖時間會不可逆地傷害細胞膜而裂解細胞。理論上說電穿孔法可用于各種細胞,且不需要另外采購特殊試劑,但需要昂貴的電轉儀。此法每次轉染需要更多的細胞和DNA,因為細胞的死亡率高。每種細胞電轉的條件都需要進行多次優化。2.細菌介導的傳染。傳染需要將目的基因克隆到特定的細菌體系中,經過包裝細胞的包裝得到改造后的細菌,再進行傳染。優點是轉染效率特別高,尤其是難以轉染的原代細胞、細胞。缺點是...
轉染方式:細胞由帶負電荷的磷脂雙分子層構成,這對大分子物質來說是個不可透過的屏障,比如DNA和RNA的磷酸骨架,其也帶負電荷。為了使核酸穿過細胞膜,研究人員開發了多種技術,大致分為三類:化學方法---利用載體分子包被核酸使其呈現中性電荷或正電荷。生物方法---利用基因工程細菌轉染非細菌基因到細胞中。物理方法---在細胞膜表面產生一個瞬時的孔從而導入DNA。然而,沒有一種方法適用于所有的細胞和實驗,理想的方法應根據您的細胞類型和實驗需要進行選擇,理想的方法應具有高轉染效率,低細胞毒性和對正常生理學的影響較小,并且易于使用和可重復性等特點。使用基質珠做為固相支持可以使貼壁細胞懸浮生長。蕪湖細胞高效...
細胞轉染那些事兒:1.設置陰性和陽性對照:一般在轉染后24-48h,靶基因即在細胞內表達。可依據不同的實驗目的,24-48h后即可進行靶基因表達的檢測等實驗。2.轉染后效率的檢測方法:觀察轉染后細胞熒光情況;qPCR驗證;WB檢測敲減或過表達蛋白。3.轉染效率低,可采取以下兩種方法:1)復轉染,即轉染后12-24h再進行轉染,前提是該細胞對脂質體的耐受性較好,轉染后細胞死亡數較少。2)通過藥篩來殺死未轉入成功的細胞,前提是該質粒帶有物品抗性的基因。4.電轉時,不同的細胞需要的電壓是不一樣的,需要做預實驗,摸索較佳條件。對于大多數細胞而言,較佳電壓位于250-1250v/cm。電擊后,應該將DN...
細胞電轉染實驗的幾點建議:1.電場強度要合適合適的電場強度對于電轉染實驗非常重要,電場強度不能過高,過高會增加細胞的死亡率;也不能過低,過低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同細胞系具有不同的較佳場強值,實驗前應測定所轉染細胞系的較佳電場強度。2.細胞狀態要好用于電轉的細胞一般選取處于對數生長期的細胞(15代以內,傳代后2d)。因為處于對數生長期的細胞分裂旺盛,表面結構致密比穩定期的細胞差,電轉后,細胞膜的恢復能力強,而且處于有絲分裂期的細胞更容易接受外源DNA.在一般實驗室中很難普及。其它物理和化學介導的轉染方法,則各有其特點。徐州昆明細胞高效轉染試劑影響轉染試驗的因素:細胞狀態變化:(...
細胞轉染操作方法:轉染,是將外源性基因導入細胞內的一種專門技術。隨著基因與蛋白功能研究的深入,轉染目前已成為實驗室工作中經常涉及的基本方法。轉染大致可分為物理介導、化學介導和生物介導三類途徑。電穿孔法、顯微注射和基因屬于通過物理方法將基因導入細胞的范例;化學介導方法很多,如經典的磷酸鈣共沉淀法、脂質體轉染方法、和多種陽離子物質介導的技術;生物介導方法,有較為原始的原生質體轉染,和現在比較多見的各種細菌介導的轉染技術。理想細胞轉染方法,應該具有轉染效率高、細胞毒性小等優點。細菌介導的轉染技術,是目前轉染效率較高的方法,同時具有細胞毒性很低的優勢。但是,細菌轉染方法的準備程序復雜,常常對細胞類型有...
具有細胞毒性極低、轉染后細胞存活率高,生成可信任的生理學相關數據。2.操作簡便、節省時間,只需對X-tremeGENE9DNA轉染試劑進行簡單稀釋,再與質粒DNA共同孵育,即可直接向細胞添加反應混合物(有無血清均可)。3.對于常用細胞無需進行費時費力的優化工作。X-tremeGENEHPDNA轉染試劑簡介:X-tremeGENEHPDNA轉染試劑是一種高效的無動物源成分的低毒轉染試劑,兼容含血清或不含血清的培養基,可用于轉染各類真核細胞(包括昆蟲細胞)以及多種難轉染細胞系。優勢:直到外源基因在細胞分裂過程中因各種因素丟失為止。深圳細胞高效轉染試劑直銷廠家細胞轉染為什么不能加血清:傳統的轉染試劑...
細胞轉染,你至少要掌握以下幾點:胞轉染是指將外源分子如DNA,RNA等導入真核細胞的技術。隨著分子生物學和細胞生物學研究的不斷發展,轉染已經成為研究和控制真核細胞基因功能的常規工具。在研究基因功能、調控基因表達、突變分析和蛋白質生產等生物學試驗中,其應用越來越普遍。可分為瞬時轉染,穩定轉染等。瞬時轉染是指外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中,因此一個宿主細胞可存在多個拷貝數,產生高水平的表達,但通常只持續幾天,多用于啟動子和其他調控元件的分析。一般來說,超螺旋質粒DNA轉染效率較高,在轉染后24-72h內分析結果,常常用到一些報告系統如熒光蛋白,β半乳糖苷酶等來幫助檢測。穩定轉染是指外源DN...
轉染的注意事項:用于蛋白生產的細胞的轉染可以在添加有血清或無血清培養基中進行。但更傾向于使用無血清培養基表達蛋白,因為血清蛋白會干擾下游表達蛋白的純化。無血清培養基一般針對某一特定細胞類型優化并有幾類無血清培養基不需要添加血清,一般含有不均一的或大量的蛋白(但比添加血清的培養基低得多)。無蛋白培養基不含蛋白但可能含有不明成分的抽提物,限定化學成分的培養基不含有蛋白或未知組成的成分。多種多樣的配方使您可以選擇較適合您應用的一種。在含血清時轉染的細胞可以適應無血清培養基,無蛋白培養基或限定化學成分的培養基。在部分情況下(如293-F,293-H,COS-7和CHO-S),對于已適應無血清或無蛋白培...
大多數已建立的細胞系都是非整倍體,原代培養包括了表達不同基因組合的細胞的混合物。細胞培養在實驗室中保存數月和數年后會經歷突變,總染色體重組或基因調控變化等而演化,這會導致和轉染相關的細胞行為的變化。如果隨時間發現這種變化,融化一管新鮮的細胞可能會恢復原先的轉染活性。比如,新鮮融化的NIH3T3細胞比傳代8次的細胞表現出更高的轉染效率,融化細胞的進一步傳代并沒有降低轉染效率。因此,如果觀察到轉染效率降低,可以試著轉染新鮮培養的細胞以恢復較佳結果。來指示細胞中目標基因是否存在,這樣的報告基因一般可以在轉染后一兩天內檢測到。青島細胞高效轉染試劑廠家批發價細胞轉染效率影響因素:1.細胞密度一般來說,當...
細胞轉染之PEI轉染法:1.細胞分盤:通過胰酶消化收集細胞,用適當的完全培養基以1×105至4×105細胞/cm2的密度平鋪細胞于35mm培養皿上(根據實驗需要選擇培養皿,使細胞貼壁后所占面積達到培養皿總面積的70-90%)。將細胞置于含5%CO2的37℃溫箱中孵育8-24h,當細胞貼壁完全后即可開始轉染。轉染前2h換液(用1.5ml無血清培養基置換舊的培養基)。注:PEI轉染法對細胞生長有克制作用,在換液前細胞幾乎不生長,所以需要密度比較大時做轉染。2.制備PEI-DNA混合物以35mm組織培養皿用240μl反應總體積為例。先在無菌EP管中加入120μl1×HBS,再加入質粒DNA(總量1-...
細胞轉染實驗的方法有哪些:1.脂質體法。中性脂質體是利用脂質膜包裹DNA,借助脂質膜將DNA導入細胞膜內。帶正電的陽離子脂質體則不同,DNA并沒有預先包埋在脂質體中,而是帶負電的DNA自動結合到帶正電的脂質體上,形成DNA-陽離子脂質體復合物,從而吸附到帶負電的細胞膜表面,經過內吞被導入細胞。脂質體法始于1987年,此法的出現使得轉染效率、轉染的穩定性和可重復性較大提高。陽離子脂質體細胞毒性相對較高,對不同的細胞可能會干擾細胞的代謝。2.非脂質體轉染。較新的納米聚合物轉染試劑,如Entranster試劑,納米材料,細胞毒性小,轉染效率高,漸漸成為各大實驗室的選擇轉染試劑。有血清時的轉染 血清一...
如何提高細胞轉染實驗效率:優化細胞生長狀態密切觀察您的細胞;確保它們狀態良好。在開始轉染細胞之前,先制定一個適當的種板方案,使細胞密度從轉染開始到結束都保持較佳狀態。增加成功幾率—細胞是轉染過程中的一個關鍵元素,它可以是影響結果的一致性和質量的較重要的變量。此外,還常用促有絲分裂刺激物(如,細菌轉化,生長因子,條件培養基,以及滋養細胞)來活化原代培養細胞。貼壁細胞相比較懸浮細胞—在轉染效率方面貼壁細胞和懸浮細胞之間的差異明顯。天生趨于懸浮的細胞(如HL60,Jurkat)非常難以轉染。相反,天生為貼壁的細胞(如HEK,CHO)則可適應懸浮生長的條件。是目前實驗室較方便的轉染方法之一,其轉染率較...
轉染的注意事項:用于蛋白生產的細胞的轉染可以在添加有血清或無血清培養基中進行。但更傾向于使用無血清培養基表達蛋白,因為血清蛋白會干擾下游表達蛋白的純化。無血清培養基一般針對某一特定細胞類型優化并有幾類無血清培養基不需要添加血清,一般含有不均一的或大量的蛋白(但比添加血清的培養基低得多)。無蛋白培養基不含蛋白但可能含有不明成分的抽提物,限定化學成分的培養基不含有蛋白或未知組成的成分。多種多樣的配方使您可以選擇較適合您應用的一種。在含血清時轉染的細胞可以適應無血清培養基,無蛋白培養基或限定化學成分的培養基。在部分情況下(如293-F,293-H,COS-7和CHO-S),對于已適應無血清或無蛋白培...
細胞轉染實驗的方法有哪些:1..電穿孔法。通過短暫的高電場電脈沖處理細胞,沿細胞膜的電壓差異會導致細胞膜的暫時穿孔。DNA被認為是穿過孔擴散到細胞內的。電脈沖和場強的優化對于成功的轉染非常重要,因為過高的場強和過長的電脈沖時間會不可逆地傷害細胞膜而裂解細胞。理論上說電穿孔法可用于各種細胞,且不需要另外采購特殊試劑,但需要昂貴的電轉儀。此法每次轉染需要更多的細胞和DNA,因為細胞的死亡率高。每種細胞電轉的條件都需要進行多次優化。2.細菌介導的傳染。傳染需要將目的基因克隆到特定的細菌體系中,經過包裝細胞的包裝得到改造后的細菌,再進行傳染。優點是轉染效率特別高,尤其是難以轉染的原代細胞、細胞。缺點是...
穩定轉染細胞系的篩選:生長的細胞比不分裂的細胞更快的受到GENETICIN物品的影響。轉染后,在開始篩選前等待48-72小時,使細胞表達足夠量的抗性酶,保證在開始篩選時可以自我保護。轉染后48-72小時倒掉培養基,加入含有GENETICIN物品的培養基,物品的濃度根據劑量反應曲線確定,足夠殺死未轉染細胞。因為許多因子影響到篩選所需的GENETICIN物品的較佳濃度,包括細胞類型,培養基和血清濃度等,所以有必要對每種細胞作一個劑量反應曲線,確定較佳濃度。篩選較多可能需要一周時間,因為在致死劑量的GENETICIN物品存在條件下,細胞會分裂1-2次。在次培養細胞時使用較低劑量的物品,一般是篩選劑量...
細胞轉染,你至少要掌握以下幾點:胞轉染是指將外源分子如DNA,RNA等導入真核細胞的技術。隨著分子生物學和細胞生物學研究的不斷發展,轉染已經成為研究和控制真核細胞基因功能的常規工具。在研究基因功能、調控基因表達、突變分析和蛋白質生產等生物學試驗中,其應用越來越普遍。可分為瞬時轉染,穩定轉染等。瞬時轉染是指外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中,因此一個宿主細胞可存在多個拷貝數,產生高水平的表達,但通常只持續幾天,多用于啟動子和其他調控元件的分析。一般來說,超螺旋質粒DNA轉染效率較高,在轉染后24-72h內分析結果,常常用到一些報告系統如熒光蛋白,β半乳糖苷酶等來幫助檢測。穩定轉染是指外源DN...